Nació en Sevilla en el año 1510 en una familia de orfebres, oficio que catalogó como suyo y que abandonó pronto, aunque poco se sabe de su infancia y su juventud. Sí se conoce que entre 1551 y 1552 se casó en Valladolid, con la cómica Mariana, y en segundas nupcias con Ángela Rafaela Trilles en Valencia, en 1560. Durante su estancia en Valladolid, el Ayuntamiento de esa ciudad edificó un corral de comedias para él, donde actuó en 1554 para Felipe II, cuando aún era príncipe. Introdujo mejoras en el modo de representar los espectáculos escénicos, y con su compañía propia -donde alternaba su doble condición de autor y actor- recorrió gran parte del territorio español. Así se sabe de su presencia en las ciudades de Segovia, 1558; Sevilla, 1559; Valencia, 1560; Toledo, 1561; Madrid, 1561; Sevilla, 1564; y Córdoba, 1564. Fueron famosas sus representaciones del Corpus de Sevilla en 1559 y del Corpus de Toledo en 1563. Conocido como el Terencio sevillano, fue autor dramático, poeta y comediante, y considerado como el fundador del teatro español. Elogiado por Cervantes -«fue el primero que en España sacó las comedias de mantillas y las puso en toldo, y vistió de gala…»-, su género es populista, buscando siempre el elogio y la aprobación del público en sus obras.
Su prosa tiene especial importancia porque ayuda a conocer el castellano de la época, pero las obras más conocidas de Lope de Rueda son sus famosos pasos: piezas cómicas de corta duración que se representaban como preámbulo a piezas de mayor duración y dramatismo. También eran utilizadas para entretener al público entre «jornada y jornada». En ellos, los protagonistas son caricaturas de personajes cotidianos del pueblo (el amo, el criado, el bachiller,…) con los que cualquiera de los asistentes se podía identificar. Sin duda fueron un preámbulo a los posteriores entremeses cervantinos.
Sus obras fueron publicadas por Juan de Timoneda en tres volúmenes. De ellas, las más interesantes fueron los pasos, especialmente el de Las aceitunas, aunque no ha de perderse el lector otros como El deleitoso, La carátula, El convidado, El rufián cobarde, La generosa paliza, Los criados, Cornudo y contento, Los lacayos ladrones, y Pagar y no pagar; algunos de ellos recogidos en la colección de pasos Registro de representantes. Se le atribuye el Diálogo sobre la invención de las calzas, donde se ridiculiza las modas de su tiempo. Escribió, además, tres coloquios pastoriles: Camila y Tymbria, en prosa, y Prendas de amor, en verso; y cinco comedias: Medora, Eufemia, Engañados y Armelina, en prosa, y Disputa y cuestión de amor, en verso. Murió en Córdoba en el año 1565.